活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)在《生物技術(shù)實(shí)踐》(選修1)中的應(yīng)用
?王美華
生物學(xué)高考以能力立意為主導(dǎo)，考查考生對(duì)所學(xué)相關(guān)課程基礎(chǔ)知識(shí)、基本技能、基本思想、基本活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)的整體掌握程度和綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)發(fā)現(xiàn)問題、提出問題、分析、解決實(shí)際問題的能力；注重對(duì)科學(xué)探究能力、科學(xué)過程與方法和創(chuàng)新精神的考查。而目前高中階段生物實(shí)驗(yàn)課時(shí)偏緊，大多實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐活動(dòng)僅能完成一遍，要談基本的活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)，學(xué)生回憶時(shí)往往有一定的難度，《生物技術(shù)實(shí)踐》（選修1）更以實(shí)踐活動(dòng)為主，而學(xué)生基本活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)普遍缺乏。為幫助學(xué)生實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)，以《生物技術(shù)實(shí)踐》（選修1）中部分課題為例，現(xiàn)將基本的活動(dòng)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下，供復(fù)習(xí)參考。
1? 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用
1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器的選擇和處理
（1）葡萄沖洗的次數(shù)。葡萄用清水沖洗1～2遍即可。沖洗的主要目的是洗去浮塵，注意不要反復(fù)多次沖洗，以防止葡萄皮表面的酵母菌種的流失。另應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)。
（2）果酒發(fā)酵裝置中排氣管的選擇。排氣管為長(zhǎng)而彎曲的膠管，在發(fā)酵過程中既能排出產(chǎn)生的C02 ，又能防止空氣中雜菌的污染。
（3）腐乳制作中選用豆腐的含水量。選用豆腐的含水量為70%左右，用含水量過高的豆腐制作腐乳，不易成形。
（4）腐乳制作鹵湯中酒含量的控制。酒的含量應(yīng)控制在12%左右。酒精含量過高，腐乳成熟的時(shí)間將會(huì)延長(zhǎng)；酒精含量過低，不足以抑制微生物的生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致豆腐腐敗。
1.2 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
（1）果酒發(fā)酵中，葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時(shí)要留1/3的空間。目的是先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸快速繁殖，耗盡02 后再進(jìn)行酒精發(fā)酵；防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生的C02 造成發(fā)酵液的溢出。
（2）果酒發(fā)酵時(shí)，每隔12h左右將瓶蓋擰松一次或打開排氣管，發(fā)酵后期擰松瓶蓋或打開排氣管的間隔時(shí)間可延長(zhǎng)。發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的C02 ，排氣是防止瓶?jī)?nèi)壓力升高引起爆炸，后期因產(chǎn)生C02 量的減少，瓶中氣壓變化不大。
??? （3）果醋發(fā)酵中 ，要適時(shí)通過充氣口充氣，以有利于醋酸菌的代謝。醋酸菌是好氧菌，將酒精變成醋酸時(shí)需要氧氣的參與。
（4）腐乳制作中加鹽腌制時(shí)用鹽量。分層加鹽，并隨層數(shù)的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì)；鹽的濃度過高，會(huì)影響腐乳的口味。
（5）裝瓶時(shí)，操作要迅速小心。將腐乳咸坯擺入瓶中，加入鹵湯和輔料后，將瓶口用酒精燈加熱滅菌，用膠條密封，以防止瓶口被污染。
1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
（1）果酒發(fā)酵中有無雜菌污染。在缺氧、呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受到抑制。
（2）一般情況下，葡萄酒呈紅色的原因。在發(fā)酵過程中，隨著酒精度的提高，紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液，使葡萄酒呈紅色。
（3）果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重鉻酸鉀來檢驗(yàn)。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色，檢測(cè)時(shí)，先在試管中加入發(fā)酵液2mL，再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol／L的H2SO43滴，振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色的變化。為使檢驗(yàn)的結(jié)果更有說服力，還應(yīng)設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
（4）影響腐乳風(fēng)味的因素。①菌種和雜菌：菌種是生產(chǎn)發(fā)酵的關(guān)鍵，如果菌種退化則表現(xiàn)出生化功能的變化，如水解速率、代謝產(chǎn)物等都會(huì)發(fā)生變化，從而影響品質(zhì)。如有雜菌污染則直接影響產(chǎn)品的色、香、味。②溫度：溫度影響菌絲的生長(zhǎng)和代謝，如溫度過低，則菌絲生長(zhǎng)緩慢，不能進(jìn)入豆腐塊的深層；溫度高，菌絲易老化和死亡，影響品質(zhì)。溫度還影響生化反應(yīng)速度。③發(fā)酵時(shí)間：發(fā)酵時(shí)間影響生化反應(yīng)度及生化產(chǎn)物的量。④調(diào)味品：加入的各種酒類、糖類等輔料的多少也對(duì)口感有重要影響。
2? 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用
2.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器的選擇和處理
(1)滅菌方法的選擇。接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。
（2）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時(shí)，稱取牛肉膏和蛋白胨時(shí)動(dòng)作要迅速。目的是防止牛肉膏和蛋白胨吸收空氣中水分。
（3）平板冷凝后，要將平板倒置。防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。
（4）菌種保藏。對(duì)于頻繁使用的菌種，采用臨時(shí)保藏法，對(duì)此種保存的菌種3～6個(gè)月后需重新接種；對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏法。將菌種放在低溫環(huán)境中保藏的目的是降低微生物的新陳代謝速度，延緩菌種衰老。
2.2 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
（1）利用平板劃線法進(jìn)行微生物接種，把聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，為達(dá)到這一目的，操作上應(yīng)注意：①除第一次劃線外，每次劃線前要灼燒接種環(huán)；②冷卻后從上一區(qū)劃線末端開始劃；③首尾區(qū)劃線不相連。
（2）取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種。
（3）平板劃線法最后灼燒接種環(huán)的目的。防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者自身。
2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
（1）培養(yǎng)基的制作是否合格。如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。
（2）接種操作是否符合無菌要求。如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。
?（3）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄。培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。
3? 酶的研究與應(yīng)用
3.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器的選擇和處理
?（1）探討含有蛋白酶洗衣粉的洗滌效果時(shí)，布料的選擇。絲綢布料不合適，因?yàn)榻z綢的主要成分是蛋白質(zhì)，它會(huì)被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，損壞衣物。
???? （2）酶制劑應(yīng)用的缺陷：①通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活；②溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；③反應(yīng)后酶會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。
???? （3）酵母細(xì)胞活化時(shí)容器的選擇。向干酵母粉加蒸餾水，使酵母細(xì)胞由休眠狀態(tài)重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞活化時(shí)體積會(huì)變大，因此活化前應(yīng)選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。
3.2 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
（1）探討加酶洗衣粉的最適溫度時(shí)，不僅要用科學(xué)探究的方法研究日常生活中的問題，還需要將研究的結(jié)果應(yīng)用到實(shí)際生活中去。這就需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)當(dāng)?shù)匾荒曛械膶?shí)際氣溫變化來確定水溫。通常情況下，冬季、春季、秋季、夏季可分別選取5℃、15℃、25℃和35℃的水溫，因?yàn)檫@4個(gè)水溫比較符合實(shí)際情況，對(duì)現(xiàn)實(shí)也有指導(dǎo)意義。
?（2）探討加酶洗衣粉的最適溫度時(shí)，須嚴(yán)格控制無關(guān)變量。無關(guān)變量有：水量和水質(zhì)、洗衣粉的用量、衣物質(zhì)料與大小、浸泡與洗滌的時(shí)間、洗滌的方式等。
???? （3）固定化酶和固定化細(xì)胞方法的選擇。一般來說，酶更適合采用化學(xué)結(jié)合和物理吸附法固定化，而細(xì)胞多采用包埋法固定化。這是因?yàn)榧?xì)胞個(gè)大，而酶分子很??；個(gè)大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個(gè)小的酶容易從包埋材料中漏出。如果想把微生物的發(fā)酵過程變成連續(xù)的酶反應(yīng)，則應(yīng)該選擇包埋法，因?yàn)楣潭ɑ钢还潭艘环N酶，而包埋法包埋細(xì)胞可涉及到一系列的酶；如果反應(yīng)物是大分子物質(zhì)，則應(yīng)選擇化學(xué)結(jié)合法或物理吸附法固定化酶，以便反應(yīng)物與酶充分的接觸。
???? (4)海藻酸鈉溶液與酵母菌細(xì)胞混合時(shí)，溶化好的海藻酸鈉溶液須冷卻至室溫后，加入已活化的酵母細(xì)胞，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，使其混合均勻。以免高溫將酵母?xì)胞燙死。
3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
（1）判斷洗衣粉洗滌效果的標(biāo)準(zhǔn)?？稍谙礈旌蟊容^污物的殘留狀況，如：已消失、顏色變淺、面積縮小等。
???? （2）檢驗(yàn)?zāi)z珠質(zhì)量是否合格的方法。一是用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也表明制備的凝膠珠是成功的。
???? （3）觀察表明凝膠珠的顏色和形狀。如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，或者固定化酵母細(xì)胞時(shí)針筒離液面過近，高度不夠，制作失敗，需要再作嘗試。
4 ?DNA的粗提取與鑒定
4.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器的選擇和處理
（1）本實(shí)驗(yàn)選用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。
（2）DNA的析出，實(shí)驗(yàn)一般要求采用預(yù)冷的95％的酒精溶液，但對(duì)比結(jié)果顯示，常溫下的酒精溶液也可產(chǎn)生明顯效果。從理論上分析，預(yù)冷的酒精溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
???? （3）實(shí)驗(yàn)過程中兩次用到蒸餾水，目的不同。第一次目的是使成熟的雞血細(xì)胞漲破釋放出DNA，第二次目的是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。
4.2 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
??? ?（1）以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100 mL血液中需要加入3 g檸檬酸鈉，以防止血液凝固。
?（2）用洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料，加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。
?（3）加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
???? （4）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。用二苯胺試劑鑒定DNA時(shí)，要注意三點(diǎn)：一是DNA絲狀物要溶解于NaCl溶液中；二是要沸水浴加熱；三是要增加對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
（1）提取出了DNA。觀察提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備。
（2）分析DNA中的雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
?（3）同實(shí)驗(yàn)方法的比較。對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)方法，本課題可以采用分組的方法進(jìn)行比較研究。首先選取不同的實(shí)驗(yàn)材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。
（本文發(fā)表于《實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器》2013年第8期）
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